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生物芯片检测:癌症精准医疗中的纠察队
作者:管理员    发布于:2019-12-09 08:47    文字:【 】【 】【

  

  生物芯片检测:癌症精准医疗中的纠察队宝格娱乐股份有限公司官方网站,以下简称“宝格娱乐”集团创立于2008年,形成商业地产、高级酒店、文化旅游和休闲娱乐四大核心产业。 宝格娱乐现已发展成为拥有总资产150多亿元的商业帝国!官网平台主管:【QQ:652422】宝格娱乐根据卫生福利部的统计,自1982年起到2017年的国人主要死因,恶性肿瘤(癌症)已经连续36年高居首位,罹患癌症死亡的比率也逐年攀升。以普遍的癌症治疗法为例,当发现有肿瘤后,除了可借由外科手术切除外,通常还必须搭配放射线、化学、标靶治疗或免疫疗法等手段,采取一系列长期的治疗程序。

  而针对这些治疗前∕后的疗效评估,或癌症复发的严密监控,传统都是通过“侵入式组织切片”方法取得检体作为主要诊断根据。但并非所有病患都适合侵入性的采检方式,例如病情严重及年龄较高的病患,或术后病人的复原状况不佳等,不允许进行穿刺或手术切片,如此会造成病情监控上的限制。

  若无法进行组织切片,可借由临床生物标志物或医学影像(包括超声波、磁振造影、正子造影、电脑断层扫描)等技术来辅助,追踪及诊断癌症病患的病情。但临床生物标志物会因外在干扰而影响准确性,灵敏度也有一定的限制;医学影像技术有造成副作用、医疗费用昂贵、检测灵敏度不高(肿瘤大小~5 mm)、判读错误等不利因素。

  除了上述医学影像技术的诊断方法外,目前公认最具发展潜力的“低侵入式诊断做法”,就是利用生物芯片当作癌症的纠察队,对病患抽出的血液进行“液态病理切片”的检测。这个方法除了不会产生副作用的风险外,还可提升检测的灵敏度及检查频率,甚至提供基因突变的信息,帮助医生有效掌握癌症病患的病情发展,以及追踪患者对各种疗程的反应等。

  在癌症病患血液中,有肿瘤释放出来到周边血液中的肿瘤游离核酸、循环肿瘤细胞及外泌体3种重要基因信息,但是过去没有适合的工具检测这些源自肿瘤的生物信息。现在有种新技术可以揪出这些蛛丝马迹,就是所谓的“液态病理切片”(可比喻是具有极高战斗力的纠察队)。

  这些在周边血液中的液态切片信息非常微量,但带有的突变证物可替代传统肿瘤切片作为癌症预后指标,甚至后续可提供病患关于个人化的基因测序、细胞治疗或药物筛选等综合性评估。随着科技医疗的进步,目前生物芯片的技术能针对10毫升以下的血液,在短时间内从1011个红血球、106至108个白血球及108个血小板的血液中,有效分离出微量的肿瘤游离核酸、外泌体,或少至5~10个的循环肿瘤细胞。

  在这3种重要基因信息中,“肿瘤游离核酸”是非常小片段的DNA,半衰期可短至2小时,因此能够即时反映出肿瘤的动态变化及异质性。另外“外泌体”是癌细胞分泌到细胞外的微小囊泡,由直径约为30至100纳米的双层脂膜所构成,内部可携带许多不同的癌症信息(如核酸、蛋白质、胺基酸、细胞代谢物等),并能扮演细胞间信息传递的角色及布置肿瘤转移前的微环境,这对癌转移的趋性有非常大的影响。

  “循环肿瘤细胞”是从原位肿瘤剥离进入血液循环系统的细胞,它的细胞核内有癌细胞特征的遗传基因或蛋白质信息。所发展的生物芯片平台若能捕捉到这些微量的细胞,可提供癌细胞增殖、代谢、血管新生、发炎、转移、药物抵抗性等精准医疗的大数据。近几年在医学上也已实行这一液态病理切片概念,例如从怀孕的母亲血液中分离出极少量源自胎儿的循环滋胚层细胞或游离核酸,以低侵入性的抽血方式取得胎儿的遗传资讯,有可能拓展应用来取代过去数十年来传统的羊膜∕绒毛膜穿刺的产前诊断手段。

  肿瘤转移至远处器官的4个主要阶段:(1)原发性肿瘤内的癌细胞转变成侵略性表现,其源自于细胞在细胞凋亡、坏死、分泌时所产生;(2)肿瘤游离核酸、循环肿瘤细胞、外泌体由原位肿瘤剥离并进入血液循环中;(3)上述3种液态切片信息经由循环散布到远端器官;(4)吸引循环肿瘤细胞于特定远端组织存活,最终适应及形成远端转移(次发性)肿瘤

  归纳一般液态切片的纯化法,对于肿瘤游离核酸的分离方式,可采取管柱萃取纯化法、试剂萃取纯化法、磁珠萃取纯化法等。外泌体的分离方式,可采用超离法(以低速离心与高速离心交替进行)、磁珠萃取纯化法,以及生物芯片技术进行。而循环肿瘤细胞的分离方式更多元化,且目前较常被临床医学所使用,因此本篇文章主要针对“循环肿瘤细胞纯化”的芯片与相关技术进行技术解析。

  综合比较世界上关于“循环肿瘤细胞富集与筛选”的生物芯片技术,虽然芯片系统处于百家争鸣的局面,大略可从“生化亲和筛选”、“物理特性筛选”、“直接分析筛选”等技术方向作区分。而这3种技术差异就像是大家玩线上游戏中的英雄角色,每位具有的能力都不同,并各有各的优缺点来对付敌人(如癌细胞)。

  事实证实单一种战斗力无法有效抵抗恼人的癌症,如何集合众家武功于一身,发展下一代“系统整合筛选”的多功能芯片系统,完全表现出癌症纠察队该有的战斗力,是目前许多研究机构与研发团队需要克服的议题。以下就针对各门派的芯片系统操作概念逐项说明。

  就“生化亲和筛选”而言,这个技术主要是根据细胞膜上的特异性蛋白,选出适合的生物标志物来分离细胞,而这些生物标志物包括专一性抗体或适配体(是类似抗体的一种单链DNA或RNA,与癌细胞膜上的特异蛋白有很高的亲和力)。一般而言,这些生物标志物可以制作在磁珠或芯片基板表面上,根据要筛选的目标细胞(针对循环肿瘤细胞或白血球细胞),进行循环肿瘤细胞的正向筛选或白血球的负向筛选。

  以磁球的筛选技术为例,借由磁球上的生物标志物抓住目标细胞膜上的特异性蛋白,再用磁力把黏有细胞的磁球移除。简单来说,这种筛选概念就像在挑拣黑白棋中的黑子,若挑出黑棋子定义为正向筛选,移除掉白棋就是负向筛选,而这也算是另一种纯化与筛选方式。

  就“物理特性筛选”而言,早期技术可凭借癌细胞与其他细胞间的密度差异,由密度梯度离心方式就可提供大量血液纯化采样。它的原理是利用循环肿瘤细胞较其他白血球与红血球的密度小的关系,以低成本且操作简单的方式分离出循环肿瘤细胞。而这个技术的缺点是会因为循环肿瘤细胞本身的异质性,造成分离出的目标细胞纯度较差,导致不利下游的基因分析与检测。

  早期的另一种技术是经由细胞的尺寸大小 / 变形性方式,进行简易且快速的细胞筛选。它的原理是利用循环肿瘤细胞具有较大的细胞直径(约10~20 µm),而其他白血球与红血球的直径约为7~12 µm的物理特性,使液态切片通过孔洞直径约为10 µm附近的滤网时,尺寸较大的循环肿瘤细胞因为其变形性不及其他血球细胞,最终卡在滤网的洞口,达到细胞纯化与筛选的功用。

  液态病理切片的生物芯片技术概述。第一类 / 生化亲合筛选:(a)磁珠正向、(b)基板表面、(c)磁珠负向;第二类 ∕ 物理特性筛选:(d)密度梯度离心、(e)尺寸 ∕ 变形性、(f)纳米魔术贴、(g)惯性力、(h)侧向位移、(i)介电泳效应、(j)微流体涡流;第三类 ∕ 直接分析筛选;第四类∕系统整合式筛选:集合以上各家武功于一身

  简单来说,这种筛选概念就像是捕鱼所用的渔网,会设计渔网的网格大小使小的鱼苗通过,而尺寸较大的成鱼才能被捕获的概念。当然,这种技术潜在的缺点主要来自于癌细胞和白血球有尺寸重叠的问题,因此循环肿瘤细胞有可能通过滤网或微柱的间隔而漏掉,造成筛选效率上的损失。值得注意的是,其他物理特性筛选多半建构在微流体的科学技术上,主要是在微纳米尺度空间中能精确控制和操控流体(在这里就是液态切片检体)。

  以物理特性的纳米魔术贴技术为例,在微流体的基板上若制作某些特殊的纳米结构,有机会增加循环肿瘤细胞与基板的交互作用,进而使循环肿瘤细胞在短时间内(<1小时)贴附在纳米结构基板上。它的原理主要是癌细胞相较于正常细胞有较长的表面绒毛结构,当癌细胞接触到纳米结构的表面时,它的绒毛会陷入纳米结构中而纠缠在一起。

  这种筛选概念就像包便当使用的魔术贴束带,癌细胞表面就如同魔术贴一面的钩状结构,纳米结构则像是魔术贴另一面平软的环状结构,当其间有作用力造成接触时,钩与环会结合形成紧固的状态。近期研究证实,当在纳米结构基板表面再接上生物标志物时,物理特性加上生化亲和筛选展现了1+1大于2的癌细胞捕捉效率,远比单纯纳米结构或单纯生化亲合筛选的能力佳。

  经由这种“纳米结构”及“生化亲和”的协同作用,若再搭配微流体涡流的功能,造成液态切片在芯片中的行经路径从直线运行变成左拐右弯,可有效提升癌细胞与纳米魔术贴的碰撞频率,使这类生物芯片表现优异,具有超过90%的癌细胞捕捉效率。

  以另一种物理特性的惯性力技术为例,生物芯片内设计有单螺旋通道,能提供梯度剪切与管壁效应两种惯性力。若在单一通道入口处注入液态切片检体(包括微量肿瘤细胞与众多白血球),经过旋转惯性力的效应后,通道出口端靠近外侧的出口会收集到尺寸较小的白血球,在靠近内侧出口的地方则有机会收集到尺寸较大的微量循环肿瘤细胞。这种筛选概念就像去水上乐园玩的回旋式滑水道,若爸爸带3位小朋友同时从入口端滑下,惯性力会使3位小朋友出现在外侧出口端,而爸爸会从内侧的滑水道出口滑出来。

  另一种细胞力学的筛选概念是侧向位移技术。原理是在芯片通道中设计相对于流体流动方向呈一定角度或几何构造的微柱阵列,使尺寸大的循环肿瘤细胞会发生侧向位移朝向一侧流出,尺寸小的其他血球则会按原流体的流动方向移动,凭借的是尺寸不同的细胞在流动过程中呈现不同的运动轨迹。

  若在芯片通道中设计两个出口,这种技术就有机会纯化并收集到微量的癌细胞。这种筛选概念就像去夜市打的弹珠台,若是有大小两种弹珠,会发现大弹珠偏向集中落到边缘的区域,而小弹珠汇聚到弹珠台中间的地方。虽然上述两种物理方式可有效降低芯片筛选的成本及时间,以及提升筛选后细胞的存活率,但是因为现时的人体血液中的生物异质性较大,因此这类技术常导致癌细胞捕捉效率偏低,或常有堵塞的问题产生。

  目前“系统整合筛选”生物芯片的循环肿瘤细胞释放术,以及个人化精准医疗的示意图

  最后一种物理特性的介电泳技术,主要原理是在外加电场的条件下,使细胞带电而悬浮,但依极化的程度不同,会顺着外加电场方向排列在微芯片上。接着外加偏压于两端电极上,细胞便会因不均匀的电场产生不同程度的漂移运动,借由免疫萤光染色的细胞标定循环肿瘤细胞,并以介电泳动的方式操控细胞移动或分离。这项技术可以在生物芯片中精确控制细胞位置到特定区域收集细胞,能达到很高的癌细胞捕捉纯度。

  这种系统的缺点是芯片系统昂贵,且需要先用磁珠对白血球进行初步的负向筛选,注入微芯片中需要耗时的细胞染色、规划细胞收集路径等,大大阻扰其于临床的实际应用。简单来说,这种筛选概念就像玩“推箱子”的电动小游戏,必须先用细胞染色法判定要推哪些箱子(癌细胞),然后还要规划好移动路径,慢慢把在电极上的循环肿瘤细胞以介电泳方式一个一个移到芯片外收集细胞的区域。

  关于“直接分析筛选”技术,主要原理是借由光学或电性的测量,执行快速和大规模的循环肿瘤细胞筛选,但须建立在完整的自动控制与大数据处理的软硬体配合。以临床应用为例,这技术还是必须搭配萤光染色目标细胞,再通过光学元件进行影像扫描,判读出目标细胞;或以免疫磁球协助电子元件判断电压受磁场下的差异性,才能对癌细胞进行大量快速分析。

  这种筛选法的硬体及耗材成本门槛高,也是这个技术无法普遍的因素。简单来说,这类方法的筛选概念就像发展一台功能强大的验钞机,要先在真钞上放入防伪标志后,才能判定没有防伪标志的假钞,然后再一张一张把真假钞分类出来。

  如今的“系统整合筛选”技术,除了能提供高纯度、高效率及高细胞活性的循环肿瘤细胞外,如何从生物芯片上释放已捕获的癌细胞,甚至是提供单颗细胞释放来分析癌细胞异质性,是“液态切片芯片技术”目前努力发展的方向。

  不久的将来,若生物芯片能有效进行个人化的精准医疗分析与测试,将能大幅提升癌症病患的治疗效果与病情监控品质,使癌症不再是闻之色变的绝症。返回搜狐,查看更多

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